無菌室標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)程與驗收規(guī)范(含《潔凈室沉降菌測試標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》)

1.目的

　　本規(guī)程旨在為無菌操作及無菌室的保護提供一個標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)程。

2.適用范圍

　　生測實驗室

3.責(zé)任者

　　QC主管生測員

4.定義

　　無

5.安全注意事項

　　嚴(yán)格無菌操作，防止微生物污染；操作人員進入無菌室應(yīng)先關(guān)掉紫外燈。

6.規(guī)程

　　6.1.無菌室應(yīng)設(shè)有無菌操作間和緩沖間，無菌操作間潔凈度應(yīng)達(dá)到10000級，室內(nèi)溫度保持在20-24℃，濕度保持在45-60%。超凈臺潔凈度應(yīng)達(dá)到100級。

　　6.2.無菌室應(yīng)保持清潔，嚴(yán)禁堆放雜物，以防污染。

　　6.3.嚴(yán)防一切滅菌器材和培養(yǎng)基污染，已污染者應(yīng)停止使用。

　　6.4.無菌室應(yīng)備有工作濃度的消毒液，如5％的甲酚溶液，70％的酒精，0.1％的新潔爾滅溶液，等等。

　　6.5.無菌室應(yīng)定期用適宜的消毒液滅菌清潔，以保證無菌室的潔凈度符合要求。

　　6.6.需要帶入無菌室使用的儀器，器械，平皿等一切物品，均應(yīng)包扎嚴(yán)密，并應(yīng)經(jīng)過適宜的方法滅菌。

　　6.7.工作人員進入無菌室前，必須用肥皂或消毒液洗手消毒，然后在緩沖間更換專用工作服，鞋，帽子，口罩和手套(或用70%的乙醇再次擦拭雙手)，方可進入無菌室進行操作。

　　6.8.無菌室使用前必須打開無菌室的紫外燈輻照滅菌30分鐘以上，并且同時打開超凈臺進行吹風(fēng)。操作完畢，應(yīng)及時清理無菌室，再用紫外燈輻照滅菌20分鐘。

　　6.9.供試品在檢查前，應(yīng)保持外包裝完整，不得開啟，以防污染。檢查前，用70％的酒精棉球消毒外表面。

　　6.10.每次操作過程中，均應(yīng)做陰性對照，以檢查無菌操作的可靠性。

　　6 .11.吸取菌液時，必須用吸耳球吸取，切勿直接用口接觸吸管。

　　6.12.接種針每次使用前后，必須通過火焰灼燒滅菌，待冷卻后，方可接種培養(yǎng)物。

　　6.13.帶有菌液的吸管，試管，培養(yǎng)皿等器皿應(yīng)浸泡在盛有5%來蘇爾溶液的消毒桶內(nèi)消毒，24小時后取出沖洗。

　　6.14.如有菌液灑在桌上或地上，應(yīng)立即用5%石碳酸溶液或3％的來蘇爾傾覆在被污染處至少30分鐘，再做處理。工作衣帽等受到菌液污染時，應(yīng)立即脫去，高壓蒸汽滅菌后洗滌。

　　6.15.凡帶有活菌的物品，必須經(jīng)消毒后，才能在水龍頭下沖洗，嚴(yán)禁污染下水道。

　　6.16.無菌室應(yīng)每月檢查菌落數(shù)。在超凈工作臺開啟的狀態(tài)下，取內(nèi)徑90mm的無菌培養(yǎng)皿若干，無菌操作分別注入融化并冷卻至約45℃的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約15ml，放至凝固后，倒置于30～35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時，證明無菌后，取平板3～5個，分別放置工作位置的左中右等處，開蓋暴露30分鐘后，倒置于30～35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時，取出檢查。100級潔凈區(qū)平板雜菌數(shù)平均不得超過1個菌落，10000級潔凈室平均不得超過3個菌落。如超過限度，應(yīng)對無菌室進行徹底消毒，直至重復(fù)檢查合乎要求為止。

7.參照

　　參照《藥品衛(wèi)生檢驗方法》 《中國藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》中(無菌檢查法)章節(jié) 中華人民共和國醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY/T0188.6-1995《藥品檢驗操作規(guī)程》

8.分發(fā)部門

　　質(zhì)量管理部

無菌室技術(shù)指導(dǎo)說明

　　在獲得了無菌環(huán)境和無菌材料后，我們還要保持無菌狀態(tài)，才能對某種特定的已知微生物進行研究或利用它們的功能，否則外界的各種微生物很容易混入。外界不相干的微生物混入的現(xiàn)象，在微生物學(xué)中我們叫做污染雜菌。防止污染是微生物學(xué)工作中十分關(guān)鍵的技術(shù)。一方面是徹底滅菌，另一方面防止污染，是無菌技術(shù)的兩個方面。另外，我們還要防止所研究的微生物，特別是致病微生物或經(jīng)過基因工程改造了的本來自然界不存在的微生物從我們的實驗容器中逃逸到外界環(huán)境中去。為了這些目的，在微生物學(xué)中，有許多措施。

　　無菌室內(nèi)的地面、墻壁必須平整，不易藏污納垢，便于清洗。工作臺的臺面應(yīng)該處于水平狀態(tài)。無菌室和緩沖間都裝有紫外線燈，無菌室的紫外線燈距離工作臺面1米。工作人員進入無菌室應(yīng)穿滅過菌的服裝，戴帽子。

　　當(dāng)前無菌室多存在于微生物工廠，一般實驗室則使用超凈臺。超凈臺其主要功能是利用空氣層流裝置排除工作臺面上部包括微生物在內(nèi)的各種微小塵埃。通過電動裝置使空氣通過高效過濾器具后進入工作臺面，使臺面始終保持在流動無菌空氣控制之下。而且在接近外部的一方有一道高速流動的氣簾防止外部帶菌空氣進入。

　　在條件較困難的地方，也可以用木制無菌箱代替超凈臺。無菌箱結(jié)構(gòu)簡單，便于移動，箱正面開有兩個洞，不操作時用推拉式小門擋住，操作時可以將雙臂伸進去。正面上部裝有玻璃，便于在內(nèi)部操作，箱內(nèi)部裝有紫外線燈，從側(cè)面小門可以放進去器具和菌種等。

應(yīng)用

無菌操作技術(shù)當(dāng)前不僅在微生物學(xué)研究和應(yīng)用上起著舉足輕重的作用，而且在許多生物技術(shù)中也被廣泛應(yīng)用。例如轉(zhuǎn)基因技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)等。

潔凈室沉降菌測試標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

1目的：建立潔凈室中沉降菌的測試標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，保證藥品在規(guī)定潔凈級別內(nèi)進行生產(chǎn)。

2范圍：潔凈室的沉降菌的監(jiān)測。

3依據(jù)：國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 16294-1996。

4職責(zé)：QA潔凈度監(jiān)測人員、微生物檢驗人員對本制度的實施負(fù)責(zé)。

5內(nèi)容
5.1潔凈室：對塵粒及微生物污染規(guī)定需進行環(huán)境控制的房間或區(qū)域。

5.2潔凈工作臺：一種工作臺或者與之類似的一個封閉圍擋工作區(qū)。其特點是自身能夠供給經(jīng)過過濾的空氣或氣體，如垂直層流潔凈罩、水平層流罩、垂直層流潔凈工作臺、水平層流潔凈工作臺、自凈器等。

5.3潔凈度：潔凈環(huán)境內(nèi)單位體積空氣中含大于或等于某一粒徑懸浮粒子的允許統(tǒng)計數(shù)。

5.4菌落：細(xì)菌培養(yǎng)后，由一個或幾個細(xì)菌繁殖而形成的一細(xì)菌集落，簡稱CFU。通常用個數(shù)表示。

5.5測試方法
5.5.1方法概述：本測試方法利用沉降法，即通過自然沉降原理收集在空氣中的生物粒子于培養(yǎng)基平皿，經(jīng)48小時以上培養(yǎng)，在適宜的條件下讓其繁殖到可見的菌落數(shù)，來評定潔凈環(huán)境內(nèi)的活微生物數(shù)，并以此來評定潔凈室的潔凈度。
5.5.2所用的儀器和設(shè)備
5.5.2.1高壓消毒鍋：使用時參照文件GZ-ZL-SOP-066-00進行操作。
5.5.2.2恒溫培養(yǎng)箱：必須定期對培養(yǎng)箱的溫度計進行檢定。
5.5.2.3培養(yǎng)皿：一般采用中90mm×15mm硼硅酸玻璃培養(yǎng)皿。使用前將培養(yǎng)皿置于121℃濕熱滅菌20分鐘。
5.5.2.4培養(yǎng)基：普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。將培養(yǎng)基加熱熔化，冷卻至約45℃在無菌操作條
件下將培養(yǎng)基注入培養(yǎng)皿，每皿約15m1。待瓊脂培養(yǎng)基凝固后，將培養(yǎng)基平皿放入30～35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)數(shù)小時，若培養(yǎng)基平皿上確無菌落生長，即可供采樣用，制備好的培養(yǎng)基平皿應(yīng)在2～8℃的環(huán)境中存放。
5.5.3測試步驟
5.5.3.1采樣方法：將已制備好的培養(yǎng)皿放置在預(yù)先確定的取樣點，打開培養(yǎng)皿蓋，使培養(yǎng)基表面暴露0.5小時，再將培養(yǎng)皿蓋上蓋后倒置。
5.5.3.2培養(yǎng)：全部采樣結(jié)束，將培養(yǎng)皿倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在30～35℃培養(yǎng)，時間不少于48小時。每批培養(yǎng)基應(yīng)有對照試驗，檢查培養(yǎng)基本身是否污染，可每批選定3只培養(yǎng)皿作對照培養(yǎng)。
5.5.3.3菌落計數(shù)：用肉眼直接計數(shù)，然后用5～10倍放大鏡檢查，有否遺漏。若培養(yǎng)皿上有2個或2個以上菌落重疊，可分辨時仍以2個或2個以上的菌落計數(shù)。

5.6注意事項
4.6.1測試用具要做滅菌處理，以確保測試的可靠性、正確性。
5.6.2采取一切措施防止人為對樣本的污染。
5.6.3對培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件及其他參數(shù)作詳細(xì)的記錄。
5.6.4由于細(xì)菌種類繁多，差別甚大，計數(shù)時一般用透射光于培養(yǎng)皿背面或正面仔細(xì)觀察，不要漏計培養(yǎng)皿邊緣生長的菌落，并須注意細(xì)菌菌落與培養(yǎng)基沉淀物的區(qū)別，必要時用顯微鏡鑒別。
5.6.5采樣前應(yīng)仔細(xì)檢查每個培養(yǎng)皿的質(zhì)量，如發(fā)現(xiàn)變質(zhì)、破損或污染的應(yīng)剔除。

5.7測試規(guī)則
5.7.1測試狀態(tài)
5.7.1.1沉降菌測試前：被測試潔凈室（區(qū)）的溫濕度須達(dá)到規(guī)定的要求，靜壓差、必須控制在規(guī)定值內(nèi)。被測試潔凈室（區(qū)）已消毒。
5.7.1.2測試狀態(tài)有靜態(tài)和動態(tài)兩種，并在報告中注明測試狀態(tài)。
5.7.1.3測試人員：測試人員必須穿戴符合環(huán)境潔凈度級別的工作服。靜態(tài)測試時，室內(nèi)測試人員不得多于2個人。
5.7.2測試時間
5.7.2.1對單向流，如100級凈化房間內(nèi)及層流工作臺，測試應(yīng)在凈化空調(diào)系統(tǒng)正常運行不少于10分鐘后開始。
5.7.2.2對非單向流，如10000級、100000級以上的凈化房間，測試應(yīng)在凈化空調(diào)系統(tǒng)正常運行不少于30分鐘開始。

5.8沉降菌計數(shù)
5.8.1最少采樣點數(shù)目：可按表1確定。在滿足最少測點數(shù)的同時，還宜滿足最少培養(yǎng)皿數(shù)，見表2。
表1最少采樣點數(shù)目
面積(m2)           潔凈度級別
            100  10000  100000  300000
＜10        2～3  2      2     2
≥10～＜20  4     2      2     2
≥20～＜40  8     2      2     2
≥40～＜100  16    4      2     2
≥100～＜200  40   10     3     3
注：表中的面積對于單向流潔凈室是指送風(fēng)面積，對于非單向流潔凈室是指房間面積。
表2最少培養(yǎng)皿數(shù)
潔凈度級別 所需Φ90mm培養(yǎng)皿數(shù)（以沉降0.5小時計）
  100             14
  10000            2
  100000           2
  300000           2
5.8.2采樣點的布置：工作區(qū)測試點位置離地0.8～1.5m左右（略高于工作面）?？稍陉P(guān)鍵設(shè)備或關(guān)鍵工作活動范圍處增加測點，采樣點的布置應(yīng)力求均勻，避免采樣點在某 局部區(qū)域過于集中，某局部區(qū)域過于稀疏。
5.8.3記錄：測試報告中應(yīng)記錄房間溫度、相對濕度、壓差、測試狀態(tài)及測試數(shù)據(jù)。
5.8.4結(jié)果計算：用計數(shù)方法得出各個培養(yǎng)皿的菌落數(shù)。平均菌落數(shù)的計算見下式：
m1 m2 …… mn
平均菌落數(shù)m=n
式中：m為平均菌落數(shù)；m1為1號培養(yǎng)皿菌落數(shù)；m2為2號培養(yǎng)皿菌落數(shù)；mn為n號培養(yǎng)皿菌落數(shù)；n為培養(yǎng)皿總數(shù)。
5.8.5結(jié)果評定：用平均菌落數(shù)判斷潔凈室的空氣中的微生物。
5.8.6潔凈室（區(qū)）內(nèi)的平均菌落數(shù)必須低于所選定的評定標(biāo)準(zhǔn)（見表3）。
5.8.7若某潔凈室（區(qū)）的平均菌落數(shù)超過評定標(biāo)準(zhǔn)，則必須對此區(qū)域先行消毒，然后重新測試兩次，測試結(jié)果必須合格。
表3 
潔凈級別     100級   10000級   100000級   300000級
標(biāo)準(zhǔn)（平均）  1個/皿  3個/皿    10個/皿    15個/皿